高い | 太原バンドソー株式会社

Nature Communications volume 13、記事番号: 2919 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

遺伝子的にコード化された蛍光バイオセンサーは、無傷の生物学的システムにおける化学プロセスを追跡するために使用される強力なツールです。しかし、バイオセンサーの開発と最適化は、主に候補バイオセンサーをスクリーニングする方法の技術的限界により、依然として困難で労働集約的なプロセスである。ここでは、液滴マイクロ流体工学と自動蛍光イメージングを組み合わせてスクリーニングスループットを桁違いに向上させるスクリーニングモダリティについて説明します。さらに、一度に単一のバイオセンサー特徴（例えば明るさ）のスクリーニングに限定されている現在の技術とは異なり、我々の方法は複数の特徴（例えばコントラスト、親和性、特異性）の並行評価を可能にする。バイオセンサーの機能は変動する可能性があるため、この機能は迅速な最適化に不可欠です。私たちはこのシステムを使用して、細胞内の乳酸濃度の定量に使用できる乳酸の高性能バイオセンサーを生成します。 LiLac と名付けられたこのバイオセンサーは、代謝産物のセンシングに大きな進歩をもたらし、我々のスクリーニングアプローチの力を実証しています。

遺伝子的にコード化された蛍光バイオセンサーは、代謝を研究するための重要なツールです。それらの蛍光シグナルは、高速タイムスケールでも慢性イメージングでも高い時間分解能を提供します 1,2,3,4,5。また、それらは遺伝的にコードされているため、生細胞で直接発現させ、特定の細胞タイプや細胞小器官を標的にすることができます 6,7 。単一細胞は代謝的に異なる可能性があり、代謝産物は急速に代謝回転する 8,9 ため、バイオセンサーは独自の方法で、個々の細胞におけるベースライン代謝状態と、チャレンジまたは刺激に応答した代謝摂動の正確な測定を可能にしました 1,10。

代謝産物濃度を定量するには、蛍光バイオセンサーからの読み取り値が、i) 標的リガンドの生理学的濃度に調整され、ii) そのリガンドに対して高度に特異的であり、iii) 細胞環境 (pH を含む) および発現レベルの変化に対して堅牢である必要があります。バイオセンサー自体の。このような高性能バイオセンサーを開発する唯一の方法は、それらをスクリーニングし、多くのリガンド濃度および条件にさらされた大規模なバイオセンサーライブラリーから多くの個々の変異体をアッセイすることです。

これは、バイオセンサーのスクリーニングに課題をもたらします。蛍光タンパク質やバイオセンサーを進化させるための新しいプラットフォームのエンジニアリングにおける目覚ましい進歩にもかかわらず、既存のスクリーニングでは、バイオセンサーに対してテストできる条件の数が依然として限られています。今回我々は、液滴マイクロ流体工学と自動二光子蛍光寿命イメージング（2p-FLIM）を組み合わせることにより、これらの限界を克服し、スクリーニング内容とスループットを桁違いに増加させました。蛍光寿命は、光子の吸収と光子の放出の間の平均時間であり、寿命センサーは、無傷の細胞内の小分子レベルを定量化するための高性能ツールとして登場しました 7,15,16。ここでは、マイクロスケールの透析チャンバーとして機能するゲルシェルビーズ（GSB）17と呼ばれる、マイクロ流体で生成された半透性ゲルを利用し、それらを使用して、独立して分離された何千もの寿命センサーバリアントをさまざまな条件に対してアッセイし、親和性、特異性、および応答を同時に評価しました。サイズ。

また、当社のスクリーニングシステム BeadScan を使用して、遺伝子コード化された蛍光バイオセンサーを迅速に開発および最適化する方法についても説明します。スクリーンの機能を実証するために、BeadScan を使用して、LiLac という名前の乳酸塩の高性能寿命センサーを生成しました。乳酸は解糖の重要な生成物であり、血液中を循環する主要な細胞燃料、細胞および組織全体で酸化還元状態を伝達する手段、および特定の種類の癌にとって好ましい燃料として最近評価されています18、19、20。既存の乳酸バイオセンサーは、脳やがん細胞の代謝を調査するために使用されています21、22、23、24、25、26。しかし、それぞれに定量化を困難にする限界があります（たとえば、乳酸の生理学的変化に対する感度が弱い、またはカルシウムに対する望ましくない反応）および/またはpH）。 LiLac は、大きな応答サイズ (哺乳類細胞における 1.2 ns の寿命変化と > 40% の強度変化)、生理学的 [乳酸塩] に対する特異性、およびカルシウムまたは pH の変化に対する耐性を示します。さらに、LiLac の寿命応答は非常に正確であり、正規化を必要としないため、生細胞内の乳酸濃度の定量が容易になります。したがって、LiLac は単細胞レベルで代謝を研究するための強力なツールを構成し、我々のスクリーニングアプローチの利点を実証します。

80% efficiency) as they pass a localized field generated by an electrode (10 kHz, 0.5 kV), at which point the amplified DNA is captured by the beads. c Addition of perfluorooctanol (PFO) breaks the emulsion, which separates into an aqueous phase containing the beads and an oil phase. The beads are then washed to eliminate residual unbound DNA. d The library of DNA beads is re-encapsulated in new droplets along with in vitro transcription/translation (IVTT) reagents using a custom microfluidic device that combines the two aqueous streams immediately prior to emulsification, mitigating premature transcription and mRNA cross-contamination. Only droplets containing a DNA bead will express fluorescent biosensor protein following an overnight incubation at 30 °C. e Finally, IVTT droplets are converted into durable semipermeable GSBs by controlled microfluidic merging with a mixture of agarose (gel in sol) and alginate (polyanion), followed by emulsion breakage by PFO in the presence of PAH (polycation). The two polyelectrolytes form a semipermeable shell at the surface of the gel scaffold, trapping proteins and DNA inside the gel but allowing small molecules (<2 kDa) to pass through17. Continuous exchange of ligands allows for the collection of full dose-response curves from the biosensor protein encapsulated in each gel during downstream screening. Scale bars represent 20 μm./p>200,000 clonal copies of >2 kb amplicons, and millions of beads can be prepared in parallel. However, optimal expression of soluble sensor protein was achieved with beads intentionally limited to ~100,000 copies of DNA by pre-blocking a subset of streptavidin binding sites, because more densely loaded beads sometimes led to the accumulation of visible protein aggregates within the droplet (Suppl. Fig. 1c). We also optimized the concentration of biotinylated 3’ primer included in the emPCR droplets. We found that using an excess of biotinylated 3’ primer led to poor results, presumably because the unextended original biotinylated 3’ primer competes with fully-extended biotinylated DNA for streptavidin binding sites. Therefore, we used a limiting concentration of the 3’ primer to ensure the complete extension of all biotinylated primer molecules, so that only fully extended amplicons are captured on the streptavidin beads./p>20 mL/min flow rates within a standard microscopy perfusion chamber, allowing rapid exchange of external conditions while fluorescence responses from the encapsulated biosensors are recorded using 2p-FLIM. After screening, single GSBs are retrieved with a microcapillary and DNA sequences are recovered by PCR amplification and Sanger sequencing (Suppl. Fig. 3)./p>5-fold reduced variability, and substantially higher signal to noise ratio (LiLacSNR ~ 25, Laconicdonor lifetime,SNR < 1; Suppl. Fig. 6a–c). Here, the SNR metric estimates the change in lifetime signal in cells from 0 to 10 mM external lactate relative to the average noise level at each condition. We also observed that the lifetime of the Laconic donor species varies widely across cells bathed in lactate (Suppl. Fig. 6b–c), as also observed with its FRET signal23. By comparison, the high precision of the LiLac readout suggests that the cell-to-cell variability observed with Laconic may be an artifact of the biosensor. While the source of this variability is undetermined, recent evidence suggests that Laconic may be partially degraded in cells, producing some fluorescence signal that is uncoupled from lactate binding23./p>40% (Suppl. Fig. 7), which is comparable to that of the most sensitive intensity-based lactate biosensor23, but with the added benefit of substantial pH resistance. Therefore, LiLac can also be used as an intensiometric biosensor, although additional normalization would be required for the quantitative determination of lactate levels./p>200,000 clonal copies of >2 kb dsDNA per 6 μm bead. Existing methods that immobilize primers on a bead and then amplify from the bead surface (e.g. BEAMing) are limited to ~1000 copies/bead for comparably sized amplicons and beads27,28. We presume that molecular crowding constraints at the bead surface limit amplification efficiency, while our method circumvents this problem by allowing the template DNA to be amplified in free solution in the droplet before immobilization on beads. This advance combined with optimization of the reaction conditions within the droplets allowed us to achieve micromolar expression levels of unique biosensor protein variants in IVTT droplets and subsequent GSBs./p>

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